Zabezpieczanie zbiorów muzealnych w Gdańsku rozpoczęło się jeszcze przed wybuchem II wojny światowej – w sierpniu 1939 roku przeniesiono najcenniejsze dzieła z poddasza na krużganki w razie ewentualnych nalotów bombowych. W 1941 roku zaczęto modernizować ochronę przeciwpożarową, a w piwnicy zamontowano pancerne drzwi. Miały tam zostać ukryte najdelikatniejsze obiekty ze srebra, bursztynu, porcelana i fajans. Klęska wojsk niemieckich pod Stalingradem i zbliżający się front wschodni przyspieszyły działania mające na celu uchronić gdańskie zabytki.
W latach 1943 – 1945 została przeprowadzona ewakuacja najcenniejszego wyposażenia zabytkowych budowli w Gdańsku, a także kolekcji z Muzeum Miejskiego w Gdańsku. Wytypowano szereg miejscowości w okolicach Gdańska do których miały zostać przewiezione dzieła sztuki z Gdańska – Orlinki, Giemlice, Sobowidz (43 obrazy i meble), Żelisławki (59 obrazów, księgozbiór, dokumentacja fotograficzna, rysunki), Rusocin (40 obrazów i meble), Pręgowo (obrazy i 27 drobnych obiektów t.j. wachlarze, zabytkowe oprawy książkowe, tabakierki), Tujec (39 obrazów), Stegna (258 obrazów ), Grabiny Zameczek (2 skrzynie sreber, skrzynie z obiektami z mosiądzu, cyny, miedzi, porcelaną i fajansem), Przywidz (18 skrzyń z fajansem, 7 skrzyń z porcelaną, 2 skrzynie tekstyliów, meble), Pawłowo ( 3 skrzynie z bursztynami), Mierzeszyn (rzeźba i obiekty rzemiosła artystycznego), Rzucewo (numizmaty, wyroby z kości słoniowej, meble), Sobowidz (część zbiorów graficznych, głównie grafika reprodukcyjna, rysunki).
Z polecenia gauleitera Alberta Forstera, jesienią 1944 roku, nastąpiła ewakuacja najbardziej wartościowych dzieł sztuki do Halle i zamku Reinhardsbrunn w pobliżu Gotha oraz do niewielkich miejscowości u podnóża gór Rhön w Turyngii. Najcenniejsze dzieło z muzeum Portret Johanna Schwarzwaldta Hansa Holbeina Młodszego zdeponowany został w skarbcu Banku Gdańskiego. Pod koniec wojny (luty-marzec 1945 rok) przeniesiono go, podobnie jak część dzieł ukrytych pod Gdańskiem (m.in. z Żelisławek), do piwnic Wielkiej Zbrojowni. Część obiektów została zabezpieczona na krużgankach Muzeum Miejskiego – kowalstwo, meble i przeszło 400 obrazów m.in. ze zbiorów Lessera Giełdzińskiego. Niestety większość z tych dzieł spłonęła.
Przez cały okres wojenny, równolegle do akcji zabezpieczania zbiorów, Muzeum Miejskie powiększało swoją kolekcję i prowadziło działalność wystawienniczą. Nazistowskiej agresji na kraje europejskie towarzyszyła prowadzona na szeroką skalę akcja rabunkowa dzieł sztuki. Zagrabione dobra kultury były inwentaryzowane i zwożone także do Muzeum Miejskiego m.in. dzieła z kolekcji Sierakowskich z Waplewa czy kosztowności korporacji Czarnogłowych z Rygi. Rekwirowane u osób prywatnych dzieła, trafiały do domów aukcyjnych i antykwariatów prowadzonych przez nazistowskich marszandów, którzy umożliwiali zakupy niemieckim kolekcjonerom i instytucjom. Z nowych możliwości nabycia eksponatów do kolekcji muzeum korzystał także dyrektor Muzeum Miejskiego Willi Drost, wspierany finansowo przez nazistowskie władze Gdańska. W okresie sprawozdawczym 1941–1942 Muzeum pozyskało do zbiorów 72 obrazy, 30 grafik i rysunków oraz cztery rzeźby. W kolejnym okresie 1942–1943 zakupiono 14 obrazów olejnych, sześć rysunków i teczki z rycinami. W latach 1943-1944 dyrektor odbył dwie podróże do Holandii skąd przywiózł obrazy mistrzów holenderskich. Drost wzbogacił także kolekcję o dzieła gdańskich twórców t.j Fritza Pfuhlego, Stanisława Chlebowskiego, Brunona Paetscha, Johanna Carla Schultza czy Daniela Chodowieckiego. Podczas wojny do kolekcji Muzeum Miejskiego zostały zakupione m.in. obrazy: Aelbert Jacobszoon Cuyp (1620-1691) Portret męski, Philips Wouwerman (1619-1668) Jeźdźcy przed namiotem, Jan Josephszoon van Goyen (1596-1659) Chałupy nad kanałem, David Teniers Młodszy (1610-1690) Ucieczka do Egiptu, Adrian van Ostade (1610-1685), Lirnik, Ferdinand Bol (1616-1680) Anioł i Hagar na pustyni, Paulus Janszoon Moreelse (1571-1638), Portret młodej kobiety jako Minerwy, Jacob von Ruisdael (1628-1682), Krajobraz z ruinami, Jacoba Jordaensa (1593-1678) Portret dziecięcy, Alexis Grimou, Portret artysty (1678-1733).